核酸检测的自我鉴定6篇核酸检测的自我鉴定 核酸的分离纯化和鉴定 核酸包括DNA、RNA，在细胞中都与蛋白质结合而存在。 分离纯化核酸总的原则:1、保证一级结构的完整性，完整下面是小编为大家整理的核酸检测的自我鉴定6篇,供大家参考。
篇一：核酸检测的自我鉴定
的分离纯化和鉴定 核酸包括DNA、RNA，在细胞中都与蛋白质结合而存在。
分离纯化核酸总的原则 : 1、保证一级结构的完整性，完整的一级结构是研究核酸
结构和功能的基础；
减少化学、物理、生物因素对核酸的降解：
避免过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏；
避免机械剪切力以及高温煮沸；
抑制DNase或RNase的活性； 2、排除蛋白质、脂类、糖类等分子的污染。
真核DNA提取的主要步骤
真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都 可以用来制备基因组DNA。
温和裂解细胞，溶解DNA，使DNA与组蛋白分离； 采用化学或酶学方法去除蛋白质、RNA及其他大分子。
外周血白细胞DNA的提取 （NaI法）
原理
利用双蒸水低渗溶胀红细胞及白细胞膜，释放出血红蛋白及细胞核， NaI 破核膜并有效解离 DNA- - 蛋白质复合物，使核酸处于易提取状态，
再以氯仿/ / 异戊醇抽提（蛋白质变性沉淀并溶解脂类，异戊醇可减少抽提过程中的泡沫产生），离心后 DNA 存在于上层水相中，以 37%异丙醇沉淀及洗涤 DNA ，即获得白细胞 DNA 。用此法提取的 DNA 可用于 Southern 杂交、 PCR 的模板等。
【试剂】
】
1．6 mol/L NaI
2．氯仿/异戊醇(24:1 V/V)混合液，应在棕色密封瓶中保存。
3．异丙醇（isopropanol）(A.R) 4．37% 异丙醇或70%乙醇 5．双蒸水(ddH 2 O) (高压灭菌) 6．TE缓冲液 (pH 8.0)
(10 mmol/L Tris-Cl、1 mmol/L EDTA) 高压灭菌。
操作步骤
1. 取新鲜抗凝血100μ l置Ep管中, 离心10000rpm×1 min。
2. 弃上清，加ddH 2 O 200μ l, 摇匀20s。
3. 加6mol/L NaI 200μ l, 缓慢倒置摇匀20s。
4. 于管内加氯仿/异戊醇(24:1)400μ l, 缓慢颠倒混匀两相，离心10 000rpm×10min。
5. 吸取上层水相350μ l置一新Ep管中，加纯异丙醇200μ l, 混匀。
6. 室温放置15min, 离心14 000rpm×12min。
Water phase (DNA) Water phase(DNA) proteins
precipitate chloroform
/isoamyl alcohol (lipids) STEP 5
1. 标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。所用Ep管、滴头等用品及ddH 2 O、试剂等应高压灭菌，操作尽量在4℃以下进行。
2. 混匀试剂、吸取上清液等操作时应避免动作剧烈。
3. 弃去异丙醇时动作应轻，切忌甩干，以免DNA丟失。
4. 0.54-1倍的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，但对5SRNA、tRNA及多糖不产生沉淀。一般不需在低温条件下长时间放置。其缺点是易使盐类与DNA共沉淀；在DNA沉淀中的异丙醇难以挥发除去，所以常规需要70%乙醇漂洗DNA沉淀物。
5. 室温下放置16h或65℃放置1h, 可加快基因组DNA沉淀的溶解。
【 注意事项】
核酸的鉴定与分析
紫外分光光度法可用于确定核酸的浓度及纯度。
核酸的分级分离。层析技术及凝胶电泳法，凝胶电泳分离法分制备型和分析型，根据分离核酸片段的大小可选择不同参数或条件的琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
核酸杂交技术用于鉴别某个特定的片段。
多聚酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）对目的基因进行DNA序列分析及鉴定 。
DNA测序
基因表达分析（RNA详细结构和数量的分析）
DNA的鉴定 一、 紫外法测 DNA 的纯度及浓度
原理：
组成核酸的嘌呤嘧啶碱基均有紫外吸收特性，最大吸收峰在260nm，这是紫外测定核酸的基础。蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。OD值为1时相当于大约50μ g/ml双链DNA 。通过测定A260和A280的比值可估算核酸的纯度。紫外法仅用于测定浓度大于0.25μ g/ml的核酸溶液。
操作
取15μ l DNA样品于3ml双蒸水中，分别于260、280、230nm处比色并记录。
定量分析：
DNA＝A260×核酸稀释倍数(3000/15)×50/1000
=10×A260(ug/ul) 纯度分析：
DNA
A260/A280=1.8
A260/A280>1.8，有RNA杂质，用RNase消化；
A260/A280<1.7,有杂蛋白，重复抽提纯化步骤;
A260/A230<2.0，可能有盐未除尽。
注：
此法不能区分 DNA 和 RNA ，不能用于核酸粗制品的测定。
核酸凝胶电泳
核酸是带均匀负电荷的分子，在电场中向正极移动，不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。以适当浓度的凝胶介质作为电泳支持介质，具有分子筛效应，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的，此为分离、鉴定和纯化核酸片段的标准方法。
DNA的琼脂糖凝胶电泳
原理 DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向正极移动过程中, 因DNA分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。电泳时加溴化乙锭（EB），其与DNA结合形成一种荧光络合物，在254－365nm紫外线照射下可产生桔红色的荧光，可用于检测DNA。
【试剂与材料】
】
1．5×TBE缓冲液(pH 8.3)：54 g Tris碱, 27.5 g硼酸, 20 ml 0.5 mol/L EDTA(pH8.0), 加水至1 L。
2．0.5×TBE缓冲液 (pH 8.3) 3．溴化乙锭(EB)：
5 mg/ml 4．1－2% 琼脂糖凝胶: 琼脂糖1－2 g加至100 ml 0.5×TBE缓冲液, 加热熔解备用。
5．6×凝胶上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油溶于水中，4℃保存。
6．DNA分子量标准
【操作步骤】
】
1．琼脂糖凝胶板的制备：将1%－2%琼脂糖凝胶加热溶化均匀，冷却到65℃加EB至终浓度0.5μ g/ml，倒入凝胶槽，厚度约3－5mm，放置样品梳，待冷却成形后取出梳子及隔板，放入水平电泳槽中，缓冲液淹没过胶1－2mm为止。
2．加样：样品中加1/5体积的6×凝胶上样缓冲液，混匀，取15μ l加入凝胶点样孔中。同时要设立合适的DNA分子量标准物。
3．电泳：电压2－10V/cm 胶, 待溴酚蓝移至凝胶的2/3距离时，关闭电源。
4．取出凝胶块，置紫外透射反射分析仪上观察，即可见桔红色的DNA区带。
【注意事项】
】
1．加样时勿破坏样品孔，否则DNA带型不整齐。
2．上样缓冲液中适量的甘油，蔗糖或聚蔗糖400可增加样品密度，使样品均匀沉到样孔底，而溴酚蓝、二甲苯青可使样品带色，便于上样及估计电泳时间和判断电泳位置。
3．EB是一种强烈诱变剂并有中度毒性，应戴手套操作，对于含有EB的溶液用后应妥善净化处理。
4．电泳过程中，EB向阴极移动，延长电泳时间，EB会从凝胶中迁移出来，从而使小片段DNA难于检测，可将凝胶浸在0.5 μ g/ml EB溶液中重新染色后检测。
5．加样孔的加样量依DNA样品中片段的数量及大小而定，通常对0.5cm宽的加样孔，DNA上样量在0.1－0.5μ g即可有良好的观察效果。
6．小的凝胶——微型和中型凝胶的电泳一般比大凝胶要快，常用于快速分析。小胶通常要在高电压下电泳(＞10 V/cm)。应注意电泳槽盛装缓冲液的体积要相对较大。
思考题 1、分离核酸的基本原则包括哪两方面？ 2、试比较用EB进行DNA凝胶电泳前（加在上样缓
冲液中）、电泳中（加在凝胶中）、电泳后
（凝胶浸泡于EB溶液中）的染色过程，各有
何有优缺点？
篇二：核酸检测的自我鉴定
的提取与鉴定核酸的提取与鉴定核酸的提取与鉴定核酸的提取与鉴定研究对象：
基因组DNA、 质粒DNA、总RNA、 mRNA等过程：裂解：
破碎细胞， 使细胞中裂解：
破碎细胞， 使细胞中的核酸游离在裂解体系中核酸提取纯化：
使核酸与裂解体系中的其它成分， 如蛋白质、 盐及其它杂质彻底分离
• 核酸提取的主要步骤：破碎细胞破碎细胞I.材料准备II.破碎细胞或包膜——内 容物释放提取提取纯化纯化III.核酸分离、 纯化IV.沉淀或吸附核酸， 并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
总原则：①应保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子的污染。鉴定：
浓度、 纯度、 完整性鉴定技术：
分光光度技术、 凝胶电泳技术
第一节 预处理一、 样品预处理1、 组织组织有新鲜组织、 甲醛固定或石蜡包埋组织。新鲜组织先用生理盐水洗， 然后将其捣碎或剪碎，加液氮研磨成粉状， 加细胞裂解液裂解细胞；甲醛固定组织要先去掉甲醛；石蜡包埋组织要经过组织切片和二甲苯脱蜡等处理。
2、 培养细胞培养细胞需弃细胞培养液， 用缓冲液进行多次漂洗， 方可用于提取核酸。
3、 血液血液可以是新鲜血液或者冻贮血液；注意抗凝剂的选择， 一般用EDTA-Na2或枸橼酸钠， 不可使用肝素；全血离心弃血清（或血浆）
、全血离心弃血清（或血浆）
、加适量的红细加适量的红细胞裂解液（破膜液）
， 裂解红细胞， 再加适量的细胞核裂液（破核液）
， 裂解白细胞中的细胞核， 使核内DNA 释放出来。
二、 提取用具预处理（一）
DNA提取用具的处理试剂、 器材高压干燥等进行无DNA酶处理。试剂、 器材高压干燥等进行无DNA酶处理。（二）
RNA提取用具的处理
1、 提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备• 塑料制品：
使用灭菌的一次性用品。
或用0. 1％DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意: 有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀, 故不能使用氯仿处理) 。玻璃用品• 玻璃用品：使用前于180℃的高温下干烤6h以上使用前于180℃的高温下干烤6h以上， 或或在220℃下干烤3h以上。• 有机玻璃的电泳槽等, 可先用去污剂洗涤, 双蒸水冲洗,乙醇干燥, 再用3％H2O2室温浸泡10min， 然后用0. 1％DEPC水冲洗， 晾干。
• 所需溶液的配制：
必须用高压灭菌的水和RNA提取专用的化学试剂配制溶液， 用干烤过的药匙称取试剂， 把溶液装入无RNase的玻璃器皿。• 严格来说， 所有溶液均应用0. 1％DEPC于37℃处严格来说， 所有溶液均应用于处理12小时以上， 然后于100℃加热15分钟或高压灭菌15分钟， 去除残余DEPC。
• 在涉及RNA的一切操作过程中， 都应戴一次性手套和口罩， 应勤换手套。2． RNA提取中RNase污染的控制
第二节DNA的提取一、 DNA的常规提取真核生物DNA主要以核蛋白形式(DNP) 存在于细胞核中中， 因此要从细胞中提取DNA时， 必须先粉碎组织，因此要从细胞中提取DNA时必须先粉碎组织裂解细胞膜和核膜， 使核蛋白释放， 再把蛋白质除去， 再除去细胞中的糖类， 脂类、 RNA等物质， 沉淀DNA,
去除盐类， 有机剂等杂质,
得到纯化的DNA。
1、 酚-氯仿提取法
2、 浓盐法• 核糖蛋白（RNP）
与脱氧核糖蛋白（DNP）
在不同浓度的NaCl溶液中溶解度显著不同。
DNP 在0. 14mol/L NaCl溶液中溶解度最小， 仅为水中的1％的1％。当当NaCl浓度增至1mol/L时， DNP的溶解l浓度增至1l/ 时的溶解度比在水中大2倍。
利用这一性质可将DNP从破碎后的细胞匀浆中分离出来， 也可以使DNP和RNP分离，DNP的蛋白部分可用苯酚、 SDS等其他方法将其除去。
3、 玻璃棒缠绕法• 用盐酸胍裂解细胞， 然后将细胞裂解物小心铺在离心管中的乙醇上， 用一个代沟的或前端为U型的玻璃棒在这两层溶液的交界面慢慢搅动沉淀出的胶状DNA缠绕在玻面慢慢搅动， 沉淀出的胶状DNA缠绕在玻璃棒上。
玻璃棒上的DNA经多次乙醇浸泡并与室温下蒸发乙醇， 由胶状逐渐回缩，然后浸入TE缓冲液中， 使其重新吸水膨胀而和玻璃棒分离。
4、 玻璃颗粒吸附法• 首先利用含异硫氰酸胍的细胞裂解液裂解细胞，然后加入能够与DNA结合的玻璃颗粒的缓冲液，经沉淀收集结合DNA的玻璃颗粒， 利用洗脱液经沉淀收集结合DNA的玻璃颗粒， 利用洗脱液进行洗脱获得DNA。
不仅玻璃颗粒可以和DNA结合， 一定大小的硅胶颗粒也可以和DNA结合。
二、 质粒DNA的提取（1）
是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。（2）
小的1-3kb，大的可达数百kb。（3）
进入细菌，可自我复制或表达。
质粒DNA的提取有效方法• 方法：
碱裂解法； 氯化铯密度梯度分离法； 煮沸裂解法等。• 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：
培养细菌使质粒扩增养细菌使质粒扩增； 收集和裂解细菌； 分离质粒收集和裂解细菌分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA， 根据实验所需)• 选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：
质粒的大小、 大肠杆菌菌株、 裂解后用于纯化的技术和实验要求。
1、 培养细菌和扩增质粒用氯霉素抑制宿主细胞的蛋白质合成， 从而抑制染色体的复制和分裂而抑制染色体的复制和分裂； 质粒的复制系质粒的复制系统成分的半衰期较长， 使质粒得以扩增。
2、 收获细菌和溶菌细菌裂解三种方法：机械法（如超声波等）机械法如超声波等化学试剂法（如SDS等）溶菌酶－化学试剂联合法（最常用）
3、 提取质粒主要使染色体DNA与质粒DNA分离分离主要依据染色体DNA比质粒DNA分子大得多， 而且染色体DNA被断裂成线状分子， 但质粒DNA为共价闭环结构， 当加热或用酸、 碱处理DNA溶液时， 线状染色体DNA容易发生变性， 共价闭环的质粒DNA在冷却和回到中性pH时即恢复其天然构象。
当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时， 蛋白质与DNA发生变性， 当加入中和液后， 质粒DNA分子能够迅速复性， 呈溶解状态， 离心时留在上清中；能够迅速复性， 呈溶解状态， 离心时留在上清中；（1 ）
碱裂解法蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状， 离心时可沉淀下来
（2）
氯化铯密度梯度分离法• EB分子可嵌入碱基对之间， 使DNA解旋• 开环DNA或线性DNA存在游离末端易于解旋， 可结合大量EB， DNA-EB复合物含EB越多 ， 密度越小。闭环质粒DNA没有游离末端• 闭环质粒DNA没有游离末端， 不易解旋， 结合少量EB， 密度较大。不易解旋结合少量• 在饱和EB条件下， 质粒DNA密度比断裂染色体DNA密度大， 经氯化铯密度梯度离心， 可分离提取质粒DNA 。
（3）
煮沸裂解法• 通过加热， 使细菌裂解、 蛋白质和染色体DNA变性。• 降低温度， 闭环质粒DNA复性留于上清液， 染色体DNA不能复性与变性蛋白质形成沉淀， 可通过离心不能复性与变性蛋白质形成沉淀， 可通过离心出去而分离。
第三节 RNA的提取一、 总RNA的提取所有RNA的提取过程中都有五个关键点， 即：①样品细胞或组织的有效破碎；②有效地使核蛋白复合体变性；②有效地使核蛋白复合体变性；③对内源RNA酶的有效抑制；④有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；⑤对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶的活性。
常用的RNA酶抑制剂①焦碳酸二乙酯（DEPC）
：
是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。②异硫氰酸胍：
目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂。③氧钒核糖核苷复合物④RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin)
⑤其他：
SDS、 尿素、 硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。
RNA的提取方法1、 异硫氰酸胍-氯化铯超速离心法使用蛋白质强变性剂异硫氰酸胍裂解组织和有效抑制RNA酶的活性， 再进行CsCl密度梯度超速离心，RNA沉淀于管底RNA沉淀于管底， 而DNA与蛋白质在上清液中。而DNA与蛋白质在上清液中使使用这种方法， 不但能得到高质量的RNA， 而且能同时分离出细胞染色体DNA。
本法已成为提取哺乳动物细胞RNA的常规方法。
2、 盐酸胍-有机溶剂法• 盐酸胍变性蛋白质， 抑制RNA酶， 有机溶剂抽提去除蛋白质， 通过选择性沉淀RNA分子而去除DNA。
此法适用于没有超速离心设施的情况下提取细胞总RNA， 提取的RNA质量较好， 但整个操作过程繁杂费时。
3、 氯化锂-尿素法• 利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA酶，氯化锂选择性沉淀RNA。• 其缺点是有时会存在DNA污染， 氯化锂沉淀RNA会丢失丢失一些小分子RNA， 如5sRNA等。
优点是快速、些小分子如等优点是快速简便、 产量高， 尤其适用于大量样品少量组织细胞的RNA提取。
4、 一步快速热酚抽提法• 将异硫氰酸胍、 巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠（SLS）
等联合使用， 抑制RNA的降解， 裂解细胞， 增强对核蛋白复合物的解离， 使RNA与蛋白质分离然后用苯酚白质分离； 然后用苯酚、 氯仿等抽提去除蛋白质和DNA， 乙醇或异丙醇沉淀纯化RNA。便快速， 可在3小时以内处理大批样品， 对大量或少量组织的细胞RNA提取均甚合适。氯仿等抽提去除蛋白质此法操作简
二、 mRNA的提取从提取的总RNA中分离mRNA，用Oligo（dT）
-柱层析法分离：
mRNA含polyA，在高盐浓度条件下与Oligo（dT）
结合， 其他成在高盐浓度条件下与Oligo（dT）
结合， 其他成分被洗掉， 再通过低盐浓度洗脱mRNA而分离。
第四节 核酸的鉴定一、 核酸浓度检测1、 定磷法DNA和RNA中都含有磷酸， 根据元素分析获知RNA的平均含磷量为9 4%均含磷量为9. 4%， DNA的平均含磷量为9. 9%， 因此可DNA的平均含磷量为9 9%因此可从样品中测得的含磷量来计算DNA或RNA的含量。2、 定糖法RNA含核糖， DNA含有脱氧核糖， 根据这两种糖的颜色反应可对DNA和RNA进行定量测定。
3、 紫外吸收法DNA和RNA在波长260nm处有很高的吸收峰值， 用标准样品测得在波长260nm处， A260＝1时， 样品中双链DNA浓度为50 μ g/ml浓度为50 μ g/ml， 单链DNA或RNA浓度为40 μ g/ml。单链DNA或RNA浓度为40 μ g/mlDNA(μ g/μ l)
= A260× 50× 稀释倍数/1000RNA（μ g/μ l ）= A260× 40× 稀释倍数 /1000
二、 核酸纯度检测•核酸的纯度用A260/A280比值表示。OD260/ OD280＝1.8——为DNA纯品OD260/ OD280＝1.8~2.0——为RNA纯品
三、 核酸完整性检测• 核酸样本的完整性和分子量可通过琼脂糖凝胶电泳测定（RNA常采用甲醛琼脂糖变性凝胶电泳）
，溴化乙锭染色， 紫外灯观察。凝胶上DNA存在处可观察到清晰的条带• 凝胶上DNA存在处可观察到清晰的条带。
完整性良好的总RNA应该清晰地看到28s rRNA、 18s rRNA、5s rRNA的三条带， 其中28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍， 5s rRNA 较弱。完整性良
基因组DNA抽提结果电泳图
总RNA抽提结果电泳图mRNA
第五节电泳根据电泳支持介质分：琼脂糖凝胶电泳：
多用于鉴定较大核酸琼糖胶泳片段（0. 1～60kb）
， 特别是分子量测定聚丙烯酰胺凝胶电泳：
用于鉴定较小的核酸片段， 特别是DNA测序
电泳的基本原理• 电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。
许多重要的生物分子， 如蛋白质、 核酸等都具有可电离基团， 它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电， 在电场的作用下， 这些带电分子会向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下， 由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、 形状等性质的差异， 使带电分子产生不同的迁移速度， 从而对样品进行分离、 鉴定或提纯的技术。
一、 琼脂糖凝胶电泳• 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、 快速、 最常用的分离、 纯化和鉴定核酸的方法。• 琼脂糖是从琼脂中提纯出来的一种线性多糖。• 琼脂糖凝胶的制作是将适量的琼脂糖粉末悬浮于琼脂糖凝胶的制作是将适量的琼脂糖粉末悬浮于缓冲液中， 加热煮沸至溶液变为澄清， 注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。• 凝胶具有刚性的滤孔， 凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度， 低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。
琼脂糖浓度(％)线型DNA分子的分离范围(kb)0. 35～600. 61～200. 70. 8～10琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围0. 90. 5～71. 20. 9～61. 50. 2～312. 00. 1～2
琼脂糖凝胶电泳装置
• DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷， 在外加电场作用下向正极泳动。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。
不同DNA的分子量大小及构型不同， 电泳时的泳动率就不同， 从而分出不同的区带琼脂糖凝胶电泳法分离DNA不同的区带。
琼脂糖凝胶电泳法分离DNA， 主要是利用分子筛效应， 迁移速度与分子量的对数值成反比关系。
因而就可依据DNA分子的大小使其分离。主要是
• RNA可以使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。
在非变性电泳中， 可以分离混合物中不同分子量的RNA分子， 但是无法确定分子量。
只有在变性情况下下， RNA分子完全伸展， 其泳动率才与分子量成正RNA分子完全伸展其泳动率才与分子量成正比。
电泳仪电泳槽
• 操作流程大致为：凝胶的制备→胶板的制备→加样→电泳→观察和拍照。
DNA片段的琼脂糖电泳
• 琼脂糖凝胶电泳有许多优点：操作简单， 电泳速度快， 分离核酸范围广， 样品不需事先处理就可以进行电泳；电泳图谱清晰，分辨率高， 重复性好；电泳后区带易染色， 样品极易洗脱， 便于定量测定。
制成干膜可长期保存。
二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳• 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE， 是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。
聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成， 这一聚合过程需要有自由基催化完成。
常用的催化聚合合程需要有自由基催化完成方法有两种：
化学聚合和光聚合。
化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵（AP）
以及加速剂四甲基乙二胺（TEMED）
， 四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基。
凝胶孔径大小由聚合链的长度及交联度所决定。常用的催化聚合
聚丙烯酰胺凝胶形成过程示意图
• 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测核酸， 常见两种聚丙烯酰胺凝胶：
用于分离纯化双链DNA片段的非变性电泳聚丙烯酰胺凝胶和用于分离和纯化单链DNA片段的变性聚丙烯酰胺凝胶。
其转载DNA样品量片段的变性聚丙烯酰胺凝胶。
其转载DNA样品量也比琼脂糖凝胶大， 分辨力也高于琼脂糖凝胶电泳， 相差1bp的DNA片段也能分开， 但其操作复杂。
聚丙烯酰胺凝胶制胶装置
篇三：核酸检测的自我鉴定
章 核酸的提取与鉴定第一节核酸提取提取核酸的种类：基因组DNA质粒DNA总RNAmRNA
核酸提取的总原则⒈保证核酸一级结构的完整性；⒉防止污染（蛋白质、 多糖、 有机溶剂等）
；⒊防止核酸降解；
核酸提取的基本步骤⒈ 破碎细胞；⒉ 除去其他生物分子；⒊ 分离核酸；⒋ 除去杂质；⒌ 鉴定和储存
一、 质粒DNA的提取质粒：
游离于细菌染色体之外的遗传物质，特点：闭环双链DNA1~300kb能够复制
质粒DNA提取的基本步骤：⒈ 培养细菌和扩增质粒⒉ 收获细菌和溶菌⒊ 提取质粒
⒈ 培养细菌和扩增质粒培养条件：
37℃， 液体培养基中， 1 50-250r/mi n的摇床旋转的条件下培养细菌；为增加质粒拷贝数可加入氯霉素；生长情况：大肠杆菌每20mi n分裂1次， 直到最大密度
⒉ 收获细菌和溶菌收获细菌：
离心收集细菌细胞沉淀 ， 弃上清培养液；
溶菌：
破坏细胞壁和细胞膜机械法：
超声波、 捣碎机、 匀浆器等；1.溶菌酶：
破坏细胞壁溶菌酶-化学试剂联合法：3. 去污剂：
SDS(十二烷基硫酸钠) ；Tri ton X-1 00（曲拉通X-100）
等，作用：
溶解细胞膜。2. EDTA(乙二胺四乙酸盐) ：
螯合Ca2+(维持细胞壁必需)
⒊ 提取质粒: 去除染色体DNA原理：1 . 质粒DNA和染色体DNA的分子大小不同：质粒DNA分子量小2. 质粒DNA和染色体DNA的结构不同：染色体DNA断裂成线状片断质粒DNA环状DNA
提取方法：⑴ 氯化铯密度梯度分离法方法：
细菌裂解液+氯化铯+溴化乙锭（EB）超速离心
氯化铯密度梯度离心
溴化乙锭（EB）
：
降低线形DNA的密度
⑵ 碱裂解法pH>1 2（NaOH和SDS）染色体DNA片段变性解链；质粒DNA部分解链将pH调回中性(乙酸钾)变性的染色体DNA片段相互缠绕，且与蛋白质结合沉淀；离心上清液：
质粒DNA；沉淀：
染色体DNA和蛋白质；
⑶ 煮沸裂解法加热：
使蛋白质和染色体DNA变性降温：
质粒DNA复性， 染色体DNA不能复性
二、 真核生物基因组DNA
组织DNA的提取（SDS/酚法）原理：
SDS裂解细胞， 然后用酚使蛋白质变性，与水溶性DNA分离。水相（DNA）中间层（变性蛋白质）有机相
组织DNA的提取过程(4℃/灭菌器皿)匀浆组织SDS蛋白酶KEDTA酚/氯仿抽提蛋白质变性提取DNA乙醇沉淀重新溶解DNA(TE缓冲液)分离组织细胞离心取上层水相水相/有机相裂解细胞降解蛋白质抑制DNase
三、 真核生物RNARNA提取的关键：
建立一个无RNase的环境RNase的特点：
分布广、 耐高温具体操作：⒈玻璃器皿：
200℃， 烘烤4小时；⒉使用一次性无RNase的塑料制品；⒊溶液：
用0. 1 % DEPC水配制及未开封试剂配制；⒋操作人员戴一次性口罩和手套；⒌操作环境：
超净台、 冰浴；
匀浆组织4℃/细胞裂解液（异硫氰酸胍、 巯基乙醇、 SDS等）苯酚/氯仿抽提乙醇沉淀重新溶解RNA(DEPC水)㈠总RNA的提取：热酚法取上层水相离心
㈡mRNA的提取Ol i go(dT) -柱层析法原理：
真核mRNA3`端具有pol y(A)利用具有Ol i go(dT) -层析柱分离；
四、 核酸纯度鉴定方法：
紫外吸收法核酸浓度测定：1 OD值相当于50µg/ml 的双链DNA相当于40 µg/ml 的单链DNA或RNA核酸浓度计算公式：双链DNA浓度(µg/ml ) =OD260× 稀释倍数×50/1 000单链DNA或RNA浓度(µg/ml ) =OD260×稀释倍数× 50/1000
核酸纯度测定：DNA样品：
OD260/OD280≈1.8RNA样品：
OD260/OD280≈1.8-2.0
第二节核酸凝胶电泳电泳：
带电粒子在电场中向与自身电荷相反的电极移动的现象；
+-双链DNA的电泳负极到正极：
分子量由大到小
根据支持物分为：一、 琼脂糖凝胶电泳二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳的分类
电泳槽（垂直和水平）电泳仪电泳装置
一、 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是红色海藻产物琼脂中提取的一种多糖，加热到沸点后再冷却凝固就形成了良好的电泳介质；主要试剂：琼脂糖电泳缓冲液：
TBE(Tris、 硼酸、 EDTA)上样缓冲液：
溴酚蓝、 二甲苯青、 蔗糖染色剂：
溴化乙锭
操作：⒈选择琼脂糖种类、 确定浓度(根据核酸分大小)；
琼脂糖凝胶浓度(%) 分离DNA的有效范围(Kb)0.35~600.61 ~200.70.8~1 00.90.5~71 .20.4~61 .50.2~32.00.1 ~2琼脂糖凝胶浓度与分离DNA的有效范围
⑴加缓冲液⑵加热：
90度左右⒉制胶
⑶灌胶， 插入梳子（冷却40-45度后凝固 ）
；⑷将凝胶置于电泳槽中；⑸加入电泳缓冲液， 拔出梳子
⒊上样：
样品与上样缓冲液混合， 加入胶孔中；⒋接通电源， 进行电泳；
上样缓冲液的作用（监测电泳的进程； 增加样品密度）溴酚蓝(200bp)二甲苯青(1600bp)1.4%琼脂糖凝胶
⒌染色：溴化乙锭：
一种荧光染料，和双链DNA结合后， 在紫外光照射下发橙黄色荧光；
⒍检测：
紫外透射仪、 凝胶呈像分析系统
凝胶电泳的应用⒈核酸分子量的检测
⒉鉴别分子量相同而构型不同的DNA分子
⒊RNA样品质量的检测28SrRNA1 8SrRNA
二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶：
由丙烯酰胺和N,N`-甲叉双丙烯酰胺在TEMED和过硫酸铵的催化下聚合而成。特点：凝胶孔径较小；分辨率高（相差一个bp的DNA）
；适合分离5-500bp的DNA；
聚丙烯酰胺凝胶电泳分类变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（分离单链DNA）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（分离双链DNA）连续聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
第三节DNA测序一、 Sanger双脱氧链终止法二、 Maxam-Gi l bert化学降解法三、 DNA测序自动化
一、 Sanger双脱氧链终止法⒈建立体外DNA合成体系：待测序DNA标记引物DNA聚合酶4种dNTPddNTP
⒉调整dNTP和ddNTP的比例， 新合成的DNA链可能在任何位置加入ddNTP， 导致合成终止， 得到一系列长度不同的DNA片段
⒊变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离合成的DNA片段⒋放射自显影读出DNA序列（和待测DNA互补）
二、 Maxam-Gi l bert化学降解法⒈制备标记片断（四个化学降解反应体系）反应体系碱基修饰试剂硫酸二甲酯 甲基化脱G 六氢吡啶 GG+A 甲酸脱A/G碱基修饰反应主要断裂试剂断裂点G六氢吡啶 G+AC+T肼C/T开环六氢吡啶 C+TC肼+盐C开环六氢吡啶 C
⒉读序
三、 DNA测序自动化
篇四：核酸检测的自我鉴定
的提取及其组分的鉴定[ 目的]1.熟悉苯酚法提取动物组织中核酸的原理和操作方法；2.了解核酸的组成，掌握核酸组分的鉴定方法。1.熟悉苯酚法提取动物组织中核酸的原理和操作方法；2.了解核酸的组成，掌握核酸组分的鉴定方法。[ 原理]蒸馏水研磨：破坏肝细胞水饱和苯酚：使蛋白质变性，与水分层，核酸位于水相乙醇：沉淀核酸。蒸馏水研磨：破坏肝细胞水饱和苯酚：使蛋白质变性，与水分层，核酸位于水相乙醇：沉淀核酸。
[ 原理]核酸可被硫酸水解得到磷酸、戊糖、含氮碱基化合物，根据这三种物质的性质特点可用不同的方法加以鉴定：核酸可被硫酸水解得到磷酸、戊糖、含氮碱基化合物，根据这三种物质的性质特点可用不同的方法加以鉴定：1 ．磷酸 ：可与钼酸试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀。PO 4 3- +12MoO 3 2- +3NH 4 + +24H + = （NH 4 ）
3 PO 4 •12MoO 3 •6H 2 O↓+6H 2 O2 ．嘌呤：嘌呤碱可与硝酸银作用生成白色的絮状嘌呤银沉淀。：嘌呤碱可与硝酸银作用生成白色的絮状嘌呤银沉淀。3 ．核糖 ：与浓硫酸共热得到糠醛，后者与3 ，5-二羟甲苯缩合而成绿色化合物。二羟甲苯缩合而成绿色化合物。
[步骤]1 ．核酸的提取：①取兔肝1 克，剪碎置于研钵中，加2ml蒸馏水研匀，再加蒸馏水研匀，再加2ml蒸馏水混匀。②取蒸馏水混匀。②取15 ×100mm 短试管1 支，滴加匀浆液40 滴（约2ml）。③向试管中加入）。③向试管中加入90 ％苯酚溶液2ml ，充分振摇5min（注意手法，防止溶液溅出），（注意手法，防止溶液溅出），3000rpm 离心5min。④用滴管小心吸取上层水相至另一试管中（贴壁吸取，为避免吸到下层液，可留一些上层液在原试管内）。⑤加入。④用滴管小心吸取上层水相至另一试管中（贴壁吸取，为避免吸到下层液，可留一些上层液在原试管内）。⑤加入3 ml 95%乙醇，充分摇匀，直至絮状沉淀析出。⑥乙醇，充分摇匀，直至絮状沉淀析出。⑥ 3000rpm 离心5min ，弃去液体，沉淀部分即为核酸。
2 ．核酸的水解：向核酸沉淀中加2ml蒸馏水，震荡摇匀使沉淀溶解。加入蒸馏水，震荡摇匀使沉淀溶解。加入10 ％硫酸2ml ，摇匀，于沸水浴中加热7 分钟，冷却后备用。3 ．核酸的鉴定：①磷酸的鉴定：测定管 对照管核酸水解液 10 -5%硫酸 - 10钼酸试剂 10
10摇匀,沸水浴5min核酸水解液 10 -5%硫酸 - 10钼酸试剂 10
10摇匀,沸水浴5min试剂（滴）管别试剂（滴）管别
②嘌呤的鉴定：测定管 对照管核酸水解液 20 -5%硫酸 - 205％AgNO核酸水解液 20 -5%硫酸 - 205％AgNO 3 3 10 10浓氨水 5 5不可震摇！静置数分钟，观察结果。10 10浓氨水 5 5不可震摇！静置数分钟，观察结果。试剂（滴）管别试剂（滴）管别测定管 对照管核酸水解液 5 -5%硫酸 - 53，5-二羟甲苯 5
5摇匀，沸水浴10min核酸水解液 5 -5%硫酸 - 53，5-二羟甲苯 5
5摇匀，沸水浴10min试剂（滴）管别试剂（滴）管别③核糖的鉴定：
[ 注意] 苯酚、钼酸试剂及3 ，5-二羟甲苯等均有强烈的腐蚀性，操作时务必小心！若接触到苯酚，立即用二羟甲苯等均有强烈的腐蚀性，操作时务必小心！若接触到苯酚，立即用95％酒精清洗。％酒精清洗。实验中用到的第一支试管（含苯酚），不要清洗，请直接放在走廊的红色小桶内。实验中用到的第一支试管（含苯酚），不要清洗，请直接放在走廊的红色小桶内。 提取核酸时，应选用短粗试管（15 ×100mm）；鉴定时则可以选用长试管（）；鉴定时则可以选用长试管（15 ×150mm ）。
篇五：核酸检测的自我鉴定
１０ ・生堡８垦型盘查！Ｑ 塑生！旦筮箜鲞筮！翅堡！垫』 亚！尘坐坐！！：堕型坚！Ｑ 塑， ！吐箜：
盟垒２液相核酸芯片鉴定角膜常见致病真菌的初步实验研究董燕玲谢立信银红梅孙士营黄海南【摘要】目的探讨建立快速鉴定角膜常见致病真菌的液相核酸芯片检测系统及其应用于真菌性角膜炎临床快速诊断的可行性。
方法实验研究。
设计针对５种角膜常见致病真菌（ 茄病镰刀菌、 串珠镰刀菌、 尖孢镰刀菌、 烟曲霉菌及黄曲霉菌）ｒ Ｒ Ｎ Ａ 基因内转录间隔（ ＩＴ Ｓ ）区的种特异性探针，５７ 端氨基Ｃ １２修饰后与不同荧光色的微球结合， 建立液相核酸芯片检测系统。
将目的真菌的５株标准菌株和４ ２株角膜分离保存菌株的基因组Ｄ Ｎ Ａ 以一对真菌通用引物扩增并标记后用于杂交检测。实验中设立单一菌种检测与多菌种混合检测的比较， 以及芯片检测与琼脂糖凝胶电泳检测的比较， 采用配对设计资料的ｔ检验和Ｓ ｐ ｅａ ｒｍ ａ ｎ 等级相关分析对榆测结果进行统计学分析， 进而评估该检测系统的特异性、 灵敏度和重复性。
结果所建立的液相核酸芯片体系可在聚合酶链反应（ Ｐ Ｃ Ｒ ）后３ｈ内准确将５株标准菌株鉴定至菌种的水平； ４ ２株角膜分离保存菌株单次检测阳性率达９ ５． ２％； 阳性信号与背景比值位于５． ６ —１３． ３之间； 单一菌种检测和５种菌种平行检测的中位荧光强度（ Ｍ Ｆ Ｉ）差异无统计学意义（ ｔ＝ ０ ． ２５２４ ， Ｐ ＝ ０ ． ８ １３２）； Ｍ Ｆ Ｉ的变化与Ｐ Ｃ Ｒ 产物的量呈正相关（ ‘＝ １． ０ ０ ０ ０ ， Ｐ ＜０ ． ０ １）； 最低检测浓度为０ ． ９ ４ ｎ ｇＰ Ｃ Ｒ 产物， 比琼脂糖凝胶电泳低４ ０ 倍； ４ 次重复检测的变异系数在１． ８ ％～１３． ７ ％之间。
结论所建立的液相芯片检测系统具有较高的特异性、 灵敏度及重复性， 可同时完成对５种角膜常见致病真菌的菌种检测， 为液相芯片技术在临床真菌快速诊断中的应用奠定了实验基础。
ｆ 中华聪搴≯杂志， ２００９， ４５：
１１０—１１４）【关键词】
寡核苷酸序列分析； 角膜； 真菌Ｐ ｒ ｅ ｌｉｍ ｉｎ ａ ｒ ｙｓｔｕ ｄ ｙｏ ｎ ｔｈ ｅ ｕ ∞ｏ ｆ Ｄ Ｎ Ａｓｍ ｐ ｅ ｍ ｉｏ ｎａ ｒ ｒ ａ ｙｆ ｏ ｒ ｔｈ ｅ ｉｄ ｅ ｎ ｔｉｆ ｉｃ ａ ｔｉｏ ｎ ｏ ｆ ｃ ｏ ｒ ｎ ｅ ａ ｌｐ ａ ｔｈ ｏ ｇ ｅ ｎ ｉｃＤ Ｏ Ｎ ＧＹ ａ ｈ —ｌｉｎ ｇ ’ ， Ｘ ＩＥ Ｌ ｉ—ｘ ｉｎ ． Ｙ ＩＮＨ ｏ ｎ ｇ － ｍ ｅ ｉ， ｓＵ ＮＳ ｈ ｉ－ ｙ ｉｎ ｇ ， Ｈ Ｕ Ａ Ｎ ＧＨ ａ ｉ—ｒｌ皿ｒｋ ‘Ｔ ｋ Ｓ ｔａ ｔｅＫ ｅ ｙｆ ｕ ｎ ｇ ｉＬ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔｏ ｒ ｙＣ ｕ ｌｔｉｖ ａ ｔｉｏ ｎＢ ａ ｓｅ ， Ｓ ｈ ａ ｎ ｄ ｏ ｎ ｇＰ ｒ ｏ ｖ ｉｎ ｃ ｍ ｌＫ ｅｙＬ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔｏ ｒ ｙｏ ｆ Ｏ ｐ ｈ ｔｈ ａ ｌｍ ｏ ｌｏ ｇ ｙ ， Ｓ ｈ ａ ｎ ｄ ｏ ｎ ｇＥ ｙ ｅＩｎ ｓｔｉｔｕ ｔｅ，Ｑ ｉｎ ｇ ｄ ａ ｏ２ ６ ６ ０ ７ １， Ｃ ｈ ｉｎ ａＣ ｏ ｒ ｒ ｅ ｓｐ ｏ ｎ ｄ ｉｎ ｇａｕｔｈｏｒ：
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１０． ３７ ６０／ｃｒｒｍ ． ｊ． ｉｓｓｎ ． ０４１２－ ４０８１． ２００９． ０２． ００４基金项目：
国家自然科学基金资助项目（ ３０ ６ ３０ ０ ６ ３， ３０ ２７ １３９ ４ ）； 山东省科技攻关计划项目（ ２０ ０ ４ Ｇ Ｇ ２２０ ２１５４ ）作者单位：
２６ ６ ０ ７ １青岛， 山东省眼科研究所山东省眼科学重点实验窀一省部共建国家重点实验室培育基地（ 董燕玲、 谢立信、 银红梅、 孙士营）； 山东省医药生物技术研究中心（ 黄海南）通信作者：
谢立信。
Ｅ ｍ ａ ｉｌ：
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生堡堕拄盘查！Ｑ 塑生！旦筮箜鲞箍！翅ｇ 丛！』 Ｑ Ｐ 丛坐型：
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１１０ ． １１４ ）【Ｋ ｅｙ ｗ ｏ ｒｄ ｓ】
Ｏ ｌｉｇ ｏ ｎ ｕ ｃｌｅｏ ｔｉｄ ｅ ａ ｒ ｒ ａ ｙｓｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅａ ｎ ａ ｌｙ ｓｉｓ； Ｃ ｏ ｒ ｎ ｅ ａ ； Ｆ ｕ ｎ ｇ ｉ真菌性角膜炎是一种严重的致盲性眼病， 好发于以农业经济为主的发展中国家。
近年统计数据显示真菌性角膜炎在我国感染性角膜病中所占比例已高达３４． ８％一６１． ９％Ｄ － ２Ｊ， 所以， 真菌性角膜炎的早期诊断对防盲治盲意义重大。
但是， 临床现有诊断方法中除了耗时过长的真菌培养外都不能鉴定菌种， 难以有效地指导临床早期选择敏感药物或根据不同种属在角膜中的不同生长方式选择合适的手术方式， 因此寻找一种高效快速的真菌鉴定方法已是临床早期诊断的客观需要。液相芯片（ ｓｕ ｓｐ ｅｎ ｓｉｏ ｎ ａ ｒ ｒ ａ ｙ ）技术的出现和发展为真菌的基因诊断提供了崭新的技术平台。
它以不同荧光色的微球为载体， 交联不同检测目的的蛋白或核酸探针后可在液相中迅速与标记的对应待测物结合， 最后通过双通道激光系统同时完成定性和定量的检测。
液相芯片技术以微球为载体的液， 液反应方式解除了固． 液杂交芯片重复性差的技术障碍，具有灵敏、 特异、 通量高等优点， 目前已广泛应用于微生物检测等方面的研究。
本实验从临床真菌性角膜炎的诊断需要出发， 选取占角膜致病真菌约８０％…的茄病镰刀菌、 串珠镰刀菌、 尖孢镰刀菌、 烟曲霉菌及黄曲霉菌为目的真菌， 建立并优化真菌的液相核酸芯片诊断系统， 并对其检测特异性、 灵敏度及重复性进行评估， 初步探讨其临床应用的可行性。材料和方法一、 材料１． 真菌菌株：
本实验所用真菌标准菌株购于中国普通微生物菌种保藏管理中心（ Ｃ ｈ ｉｎ ａ Ｇ ｅ ｎ ｅ ｒ ａ ｌＭ ｉｃ ｒ ｏ ｂ ｉｏ ｌｏ ｇ ｉｃ ａ ｌ Ｃ ｕ ｌｔｕ ｒ ｅ Ｃ ｏ ｌｌｅ ｃ ｔｉｏ ｎＣ ｅｎ ｔｅｒ ， Ｃ Ｇ Ｍ Ｃ Ｃ ），包括茄病镰刀菌（ 编号３． １８ ２９ ）、 串珠镰刀菌（ 编号３． ４ ７ ２１）、 尖孢镰刀菌（ 编号３． ４ ７ ４ ３）、 烟曲霉菌（ 编号３． ７ ７ ２）及黄曲霉菌（ 编号０ ２７ ７ ２）各１株。
所用角膜分离保存菌株４ ２株均为山东省眼科研究所病原生物学实验室保存的角膜分离真菌， 包括茄病镰刀菌１７ 株， 串珠镰刀菌９ 株， 尖孢镰刀菌４ 株， 烟曲霉菌４ 株及黄曲霉菌８ 株。２． 主要仪器：
基因扩增仪（ 德国Ｅ ｐ ｐ ｅｎ ｄ ｏ ｒｆ 公司）、 电泳仪（ 美国Ｂ ｉｏ —Ｒ Ａ Ｄ 公司）、 紫外分光光度计（ 德国Ｅ ｐ ｐ ｅｎ ｄ ｏ ｒｆ 公司）、 Ｃ ｈ ｅｍ ｉ Ｘ Ｔ ｌ６ 凝胶成像系统（ 英国Ｓ ｙ ｎ ｇ ｅｎ ｅ公司）、 Ｌ ｕ ｍ ｉｎ ｅｘ ｌ０ ０ 检测仪（ 美国Ｌ ｕ ｍ ｉｎ ｅｘ 公司）。３． 主要试剂：
真菌Ｄ Ｎ Ａ 提取试剂盒（ 美国Ｏ ｍ ｅ ｇ ａ Ｂ ｉｏ —ｔｅｋ 公司）； 聚合酶链反应（ ｐ ｏ ｌｙ ｍ ｅｒａ ｓｅｃ ｈ ａ ｉｎｒ ｅ ａ ｃ ｔｉｏ ｎ ， Ｐ Ｃ Ｒ ）产物测序及引物合成（ 博尚生物技术有限公司）； ２× Ｔ ａ ｑ Ｐ Ｃ ＲＭ ａ ｓｔｅ ｒ Ｍ ｉｘ 及Ｐ Ｃ Ｒ产物纯化试剂盒（ 天根生化科技有限公司）； 探针合成（ 日本Ｔ ａ Ｋ ａ Ｒ ａ 公司）； 羧基化微球（ 美国Ｌ ｕ ｍ ｉｎ ｅ ｘ公司）； 液相芯片检测相关试剂（ 美国Ｓ ｉｇ ｍ ａ 公司）。二、 真菌基因组Ｄ Ｎ Ａ 的提取及其Ｐ Ｃ Ｒ 扩增分别将５株标准菌株和４ ２株角膜分离保存菌株复苏， 接种于沙氏培养基， ３７ ℃温箱培养５ ｄ ， 刮取培养基表面的真菌菌丝冰浴研磨， 取１０ ０ ｇ 磨碎的真菌组织置于离心管中， 按试剂盒说明步骤以离心柱法提取真菌基因组Ｄ Ｎ Ａ 。Ｐ Ｃ Ｒ 扩增体系：
总反应体积５０ 山， 包括２× Ｔ ａ ｑＰ Ｃ Ｒ Ｍ ａ ｓｔｅ ｒ Ｍ ｉｘ２ ５山， ｌ对真菌通用引物各２ 出（ １０Ｉｘ ｍ ｏ ｌ／Ｌ ）， 模板Ｄ Ｎ Ａ５ｎ ｇ ， 加灭菌去离子水补至５０ 山。
扩增条件：
９ ４ ℃５ ｒ ａ ｉｎ ； ９ ４ ℃３０ Ｓ ， ５３ｏ Ｃ ３０Ｓ ，７ ２ ℃ １ｍ ｉｎ ， ３５个循环； ７ ２℃１０ ｍ ｉｎ 。
所用扩增引物采用文献报道＂４ １的真菌通用引物：
Ｐ ， ． Ｔ Ｃ Ｃ Ｇ Ｔ Ａ Ｇ ＧＴ Ｇ Ａ Ａ Ｃ Ｃ Ｔ Ｇ Ｃ Ｇ Ｇ ； Ｐ ２一Ｔ Ｃ Ｃ Ｔ Ｃ Ｃ Ｇ Ｃ Ｔ ｒ Ａ Ｔ ｒ Ｇ Ａ Ｔ Ａ Ｔ Ｇ 。
反向引物Ｐ ２的５’ 端以生物素标记。
每份Ｐ Ｃ Ｒ 产物均以琼脂糖凝胶电泳初步检测扩增效果。
其中５株标准菌株的Ｐ Ｃ Ｒ 产物纯化后送交测序。三、 探针设计与合成从Ｇ ｅ ｎ ｅ ｂ ａ ｎ ｋ 获取５种目的真菌的基因序列， 将所查序列与Ｐ Ｃ Ｒ 产物测序序列以Ｃ ｌｕ ｓｔａ ｌ软件进行比对， 得到碱基对齐图， 根据上述结果应用Ｏ ｌｉ９ ０ ６． ６５和Ｐ ｒｉｍ ｅｒｐ ｒ ｅ ｍ ｉｅ ｒ ５． ０ 软件在真菌ｒ Ｒ Ｎ Ａ 基因内转录间隔（ ｉｎ ｔｅｍ ａ ｌ ｔｒ ａ ｎ ｓｃ ｒ ｉｂ ｅ ｄｓｐ ａ ｃｅｒ， ＩＴ Ｓ ）区序列中设计针对５种目的真菌的种特异性探针， 在保守区序列中设计５种真菌通用的阳性质控探针， 以无关探针作为阴性质控探针， 通过Ｃ ｌｕ ｓｔａ ｌ和Ｂ ｌａ ｓｔ万方数据
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曼尘璺！翌！Ｑ 塑， ！些箜ｔ塑垒２比对对所设计的探针进行筛选。
所设计探针在合成过程中５’ 端以氨基Ｃ １２修饰， 以备与羧基化微球交联。
探针序列如下：
茄病镰刀菌一Ｇ Ｃ Ａ Ｃ Ａ ｃ Ｇ Ｃ Ｃ Ｇ Ｔ Ｃ ＣＣ Ｔ Ｃ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ａ Ｃ ； 串珠镰刀菌． Ｔ Ｃ Ｇ 盯Ａ Ｃ Ｔ Ｇ 叽～Ａ Ｔ Ｃ Ｇ ＴＣ Ｇ Ｃ Ｇ Ｇ ； 尖孢镰刀菌． Ｃ Ｔ Ｃ Ａ Ａ Ｇ Ｃ Ｃ Ｃ Ｔ Ｃ Ｇ Ｇ Ｇ Ｔ Ｙ ｒ Ｇ Ｇ Ｔ ＧＴ ； 烟曲霉菌一Ｃ Ｇ Ｃ Ｃ Ａ Ｇ Ｃ Ｃ Ｇ Ａ Ｃ Ａ Ｃ Ｃ Ｃ Ａ Ａ Ｃ 哪Ａ ； 黄曲霉菌一７ ｒ Ｇ Ｃ Ｃ Ｇ Ａ Ａ Ｃ Ｇ Ｃ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ｃ Ａ Ａ Ｔ Ｃ Ｔ ； 阳性质控一Ｇ Ｃ ＡＴ Ａ Ｔ Ｃ Ａ Ａ Ｔ Ａ Ａ Ｇ Ｃ Ｇ Ｇ Ａ Ｇ Ｇ Ａ ； 阴性质控一Ｔ Ｉｑ ＇Ｃ Ａ Ｇ Ａ Ｔ Ｇ ＡＴ ｒ Ｃ Ｔ Ｃ Ｇ Ｇ Ｔ Ｉ？Ａ Ｃ Ｔ ｌ７ Ｇ Ｔ Ｇ Ｔ Ｃ 。四、 探针与微球的交联及样本的杂交检测按照美国Ｌ ｕ ｍ ｉｎ ｅ ｘ 公司提供的液相核酸芯片操作说明分别将各种色号的微球与相应的探针进行共价交联， 并将交联后的微球等比混匀后用于与样本的杂交及Ｌ ｕ ｍ ｉｎ ｅｘ ｌ０ ０ 分析仪检测。
实验中设立阳、阴性对照， 并以双蒸水代替Ｐ Ｃ Ｒ 反应中的Ｄ Ｎ Ａ 模板来获得背景荧光强度（ ｂ ａ ｃ ｋ ｇ ｒ ｏ ｕ ｎ ｄｆ ｌｕ ｏ ｒ ｅ ｓｃ ｅ ｎ ｃ ｅｉｎ ｔｅｎ ｓｉｔｙ ， Ｂ Ｆ Ｉ）。
分析各反应各色号微球的中位荧光强度（ ｍ ｅｄ ｉａ ｎｆ ｌｕ ｏ ｒ ｅ ｓｃ ｅ ｎ ｃ ｅｉｎ ｔｅｎ ｓｉｔｙ ， Ｍ Ｆ Ｉ）、 背景荧光强度以及信号／背景比值（ ｓｉｇ ｎ ａ ｌ． ｔｏ —ｂａ ｃｋ ｇ ｒｏ ｕ ｎ ｄ ，Ｓ ／Ｂ ）， 并以Ｓ ／Ｂ 值≥２为阳性标准” １对反应结果进行分析。
实验中所有荧光强度的数值均以校正荧光单位（ ａ ｄ ｊｕ ｓｔｅｄｆ ｌｕ ｏ ｒ ｅ ｓｃ ｅ ｎ ｃ ｅ ｕ ｎ ｉｔｓ， Ａ Ｆ Ｕ ）为单位进行计算。另外， 实验过程中设立单一菌种检测与多菌种混合检测的比较来评估液相芯片体系的平行检测能力； 设立琼脂糖凝胶电泳对照组来评估所建立芯片检测体系的灵敏度水平。五、 统计学分析方法采用Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ ｌ１． ５统计软件进行统计学分析。
以均值± 标准差（ 孟± ｓ）表示各组荧光强度值， 单一菌种芯片检测和多菌种平行检测的Ｍ Ｆ Ｉ比较使用配对设计资料的ｔ检验， Ｐ Ｃ Ｒ 产物浓度与相应Ｍ Ｆ Ｉ值的相关性采用Ｓ ｐ ｅ ａ ｒ ｍ ａ ｎ 等级相关分析。
以Ｐ ＜０． ０５作为差异有统计学意义。结果一、 Ｐ Ｃ Ｒ 结果５株标准菌株和４ ２株角膜分离保存菌株基因组Ｄ Ｎ Ａ 的Ｐ Ｃ Ｒ 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳均可见清晰、 单一的电泳条带， Ｄ Ｎ Ａ 片段大小位于５０ ０ —６ ０ ０ｂ ｐ 之间（ 图１）。
将标准菌株扩增产物纯化后测序， 可见测序所得序列与Ｇ ｅｎ ｅｂ ａ ｎ ｋ 上对应菌种的ｒ Ｒ Ｎ Ａ 序列相符合， 说明扩增所得序列片段包含探针互补序列， 符合待测Ｐ Ｃ Ｒ 产物的要求。二、 液相芯片检测结果１． 标准菌株检测结果：
在优化的反应条件下， 所建立的液相芯片检测系统可以准确地将５种目的真菌标准菌株鉴定至种的水平， 无论是只检测单一菌种还是在同一个反应体系中平行检测５种目的菌种， 都可获得稳定的阳性Ｍ Ｆ Ｉ， 且两者Ｍ Ｆ Ｉ之间的差异无统计学意义（ ｔ＝ Ｏ ． ２５２４ ， Ｐ ＝ ０ ． ８ １３２）（ 图２）； 反应过程中未发现明显的非特异性杂交。１：
茄病镰刀菌， ２：
串珠镰刀菌， ３：
尖孢镰刀菌， ４ ：
烟曲霉菌， ５：
黄曲霉菌， ６ ：
Ｄ Ｎ Ａ 相对分子质量标记图Ｉ标准菌株Ｐ Ｃ Ｒ 扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果官詈叟茄病■刀茸串珠镰刀菌尖孢镰刀菌烟曲霉菌黄曲霉菌真菌菌种图２单一菌种检测与混合菌种检测的结果比较２． 角膜分离保存菌株检测结果：
角膜分离保存菌株的芯片检测结果见表１。
以Ｓ ／Ｂ 值＞ ｔ２为阳性标准， ４ ２株角膜分离菌株中４ ０ 株可与相应的检测探针发生特异性杂交， Ｓ ／Ｂ 值位于５． ６—１３． ３之间，未见明显非特异性杂交， 单次检测阳性率达到９ ５． ２％。
另外， １株茄病镰刀菌和１株烟曲霉菌初次检测时， 因Ｂ Ｆ Ｉ过高而使Ｓ ／Ｂ 值＜ ２（ 分别为１． ７和１． ９ ）， 经调整反应条件重复测定后Ｂ Ｆ Ｉ得到控制， 可获得稳定的阳性结果。
表ｌ中的Ｍ Ｆ Ｉ、 Ｂ Ｆ Ｉ及表１角膜分离培养真菌菌株的芯片检测结果伽｛萎瑚珊瑚珊瑚∞ｏ万方数据
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呈Ｓ ／Ｂ 值均以重复检测后的平均数值计算。三、 液相芯片检测灵敏度结果及与琼脂糖凝胶电泳的比较以Ｍ Ｆ Ｉ居中的尖孢镰刀菌为例， 评估所建立芯片系统的检测灵敏度。
将尖孢镰刀菌标准菌株的扩增产物分别稀释１、 ｌＯ 、 ２０ 、 １０ ０ 、 ２０ ０ 及１０ ０ ０ 倍， 各取３“ｌ用于检测， 重复实验后取均值。
结果可见，０ ． ９ ４ ～１８ ８ｎ ｇ Ｐ Ｃ Ｒ 产物均可检测出阳性结果， Ｍ Ｆ Ｉ随待测Ｐ Ｃ Ｒ 产物浓度的降低而降低， 两者呈正相关（ ｒ， ＝ １． ００００， Ｐ ＜ ０． ０１）， ０． １８８ ｎ ｇ 时ｓ／Ｂ 值＜ ２， 不能正确鉴定出所测菌种。将尖孢镰刀菌标准菌株的Ｐ Ｃ Ｒ 产物分别稀释ｌ、 ２、 ５、 １０、 ２０、 １００、 ２００及１０００倍， 各取３一以双蒸水补足体积后用于琼脂糖凝胶电泳。
结果可见，３７ ． ６ —１８ ８ ． ０ｎ ｇ Ｐ Ｃ Ｒ 产物可见单一的５５０ｂ ｐ 左右的电泳条带， 清晰度依次降低， １８． ８ ｎ ｇ 以下未见可辨认的电泳条带。
与所建立的液相芯片检测系统相比， Ｐ Ｃ Ｒ 联合琼脂糖凝胶电泳检测的最低浓度至少需是后者的４ ０ 倍。四、 液相芯片检测重复性结果以同一批次的混合微球同时对５种标准菌株重复进行４ 次平行检测， 结果见表２。
所建立的液相芯片检测体系表现出良好的重复性， 变异系数（ ｃｏ ｅｆ ｆ ｉｃｉｅｎ ｔｏ ｆｖ ａ ｒ ｉａ ｔｉｏ ｎ ， Ｃ Ｖ ）在１． ８ ％～１３． ７ ％之间。
阳性质控为６２３７ ． ０ —６５１８ ． ０ ， ６３４ ６． ９ ４ － １２６ ． ７ ，Ｃ Ｖ 为２． Ｏ ％； 阴性质控为７ ０ ． ０ —９ ４ ． ０ ， ７ ８ ． １ ４ － １０ ． ７ ，Ｃ Ｖ 为１３． ７ ％。表２同一批次５种真菌同时进行４ 次检测的Ｍ Ｆ ｌ分析讨论液相芯片技术是近年开发出的新一代分子诊断技术平台。
根据检测水平的不同， 液相芯片又可分为液相蛋白芯片和液相核酸芯片， 液相蛋白芯片以相应的抗原或单克隆抗体作为探针， 特异性相对较强， 但是临床常见角膜致病真菌少有商品化的特异性单克隆抗体， 使其在真菌的鉴定方面应用受限， 所以目前相关研究多倾向于用液相核酸芯片技术来完成真菌鉴定。一、 种特异性探针的设计液相核酸芯片应用的前提是具备针对目的真菌的高特异性的捕获探针。
真菌ｒ Ｒ Ｎ Ａ 基因的可变区——Ｉｒｒｓ区位于高度保守的小亚基、 ５． ８ Ｓ 小亚基及大亚基之间， 对于研究真菌属内种的划分具有重要意义Ｌ ６剖。
许多研究者已经从ＩＴ Ｓ 区选择序列建立种特异性探针旧４ ’ ９ｏ 进行芯片检测。
本文所用探针也是通过对ＩＴ Ｓ２区序列进行筛选、 比对设计而成。在探针的设计过程中除了考虑探针的长度、 解链温度（ ｍ ｅｌｔｉｎ ｇ ｔｅｍ ｐ ｅｒ ａ ｔｕ ｒ ｅ， Ｔ ｍ ）、 Ｇ Ｃ 含量， 避免二聚体、 发夹结构和连续４ 个以上重复碱基外， 我们还尽量使探针互补序列靠近３’ 端、 探针与非对应序列的碱基差异达到最大程度， 并将错配区设计到探针的中央部位以防止发生非特异性杂交¨ ０ ｜。
本实验所涉及的菌种数较少， 且所选目的菌种的ＩＴ Ｓ 区之间差异较大， 所以未见明显的非特异性杂交， 仅设计单条探针即达到检测目的。
但是， 如果所需鉴别的菌种之间亲缘关系太近， 临...
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